Kinetické metody stanovení
Př:po půl minutě nastartujeme reakci a po čase zastavíme
A= 0,005
- neměříme absorbance ale rozdíl absorbancí
-krátké stanovení
-analyzátory, jednotlivé vzorky(výhodný)
Metoda: Optický test
-využívá se NAD
Vlastní stanovení ALT, AST
Rovnice-podle toho co stanovujeme
Alanin + 2 oxiglutarát = * kys.pyruvát + glutamát
Kys.aspartová(aspartát) + oxoglutarát(kys.oxoglutan) = * oxalacetát(kys.oxal oct.) + glutanát
1, fotometricky
= stanovení s dinitrofenyl hydrazinem
-metoda se nepoužívá(má dlouhou inkubační dobu)
-při mírně zvýšených hodnotách není lineární
2.) enzymová reakce (optický test)
- využívá se NADH
- vzniká pyruvát → ten pak reaguje s NADH
• (u ALT) pyruvát + NADH + H+ → *laktát + NAD+
-H2 odpadne
• ( u AST) oxalacetát + NADH + H+ → *malát(malát dehydrogenáza) + NAD+
-H2 odpadne
- malát dehydrogenáza= kys.jablečná
Stanovení aktivity ALT
- pokud je někde přítomné NADH, musíme měřit v UV oblasti
- záleží na aktivitě ALT- kolik vznikne pyruvátu tolik zreaguje NAD
-množství pyruvátu které * poté přidáme
- čím větší Absorbance tím větší množství pyruvátu
- u AST totéž, ale jiný substrát
- rychlé, kinetické stanovení
- linearita zachována do vysokých hodnot
- když je hodně vysoká-zředíme
- pokud nemáme UV fotometr, tak si reakci převedeme do viditelné oblasti (barevná
reakce)
- oba enzymy (ALT, AST) jsou stabilní v lednici 3 dny
- ALT - nemocí játra
- AST - nemocí srdce